Proteiinihydrolyysimenetelmän kehittäminen tuoreen lihan ja kalan ravitsemuksellisten hyötyjen lisäämiseksi.
Tohtori Adrian Hewson-Hughesin tieteellinen tukipaperi | Ravitsemus-, elintarviketurvallisuus- ja innovaationeuvoja, GA Pet Food Partners.
Johdanto.
Eläinproteiinipitoisuuden on vakiinnutettu olevan koirien ja kissojen korkealaatuisten ruokien ydin, ja monet lemmikkieläinten omistajat tunnustavat, että "laatu määrää määrän sijaan" -sanonta pätee tässäkin. Markkinatutkimusyhtiö Mintelin mukaan 59 % kissanomistajista ja 57 % koiranomistajista sanoo, että lihan laatu on tärkeämpää kuin lemmikkieläinruoan lihan kokonaispitoisuus. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners on tunnustanut tämän jo pitkään. Käyttöönoton jälkeen Freshtrusion®, GA on ollut edelläkävijä sellaisten ruokavalioiden kehittämisessä ja valmistuksessa, jotka sisältävät yhä suurempia määriä juuri valmistettua liha- ja kalaproteiinin lähteitä. Sekä lemmikkieläimet että niiden omistajat arvostavat hyvin tuoreen lihan ja kalan käytön etuja kuivattujen, sulatettujen liha- ja kala-aterioiden sijaan, mukaan lukien parempi maku ja parempi sulavuus.
Pyrimme tarjoamaan kumppaneillemme entistä parempia tuotteita.
Lemmikkieläinten ruokamarkkinat ovat erittäin dynaamiset, ja vaikka lihan/kalan/siipikarjan tarkan suuren osuuden korostaminen tuotteissa on viisasta, tästä on tulossa perusodotus, ei lemmikkieläinten omistajien toivottu laatu näille tuotteille. Me täällä GA:ssa pyrimme jatkuvasti löytämään tapoja tarjota kumppaneille entistä parempia tuotteita, ja siksi ryhdyimme tekemään mahdottomalta vaikuttavia asioita – keksimään tavan kypsentää tuoreet liha- ja kala-aineksemme, jotta niistä tulisi vielä parempia lemmikkieläimille. .
Ajatuksena on lisätä proteiinin ravintoarvoa tuoreissa liha- ja kalaainesosissamme muuntamalla proteiini pieniksi peptideiksi, jotka sitä syövät lemmikit imeytyvät helpommin (kutsumme sitä HDP:ksi – Highly Digestible Protein). Auttaaksemme meitä tässä tehtävässä valitsimme Norjassa toimivaan elintarviketutkimukseen keskittyvän johtavan tutkimuslaitoksen Nofimaan asiantuntijat optimoimaan olosuhteet valittujen liha- ja kalaraaka-aineiden entsymaattiselle pilkkomiselle ja analysoimaan niitä osoittaaksemme, että voimme saavuttaa haluamamme. .
Proteiinin pilkkominen – eli proteolyysi tai hydrolyysi
Proteiinit ovat suuria molekyylejä, jotka koostuvat yksittäisistä "rakennuspalikoista", joita kutsutaan aminohapoiksi. Proteolyysiprosessi alkaa proteiinipitoisen ruoan syömisen jälkeen, kun eri osissa maha-suolikanavaa vapautuvat entsyymit hajottavat sen aminohapoiksi ja pieniksi peptideiksi. Tämä mahdollistaa näiden rakennuspalikoiden imeytymisen elimistöön, jossa ne voidaan yhdistää uusien proteiinien (kuten lihasten, ihon, hiusten, vasta-aineiden, entsyymien, hormonien jne.) rakentamiseksi.
On myös mahdollista, että proteiinilähteet käyvät läpi kontrolloidun entsymaattisen proteolyysiprosessin osana niiden valmistamista käytettäviksi valmistettuihin elintarvikkeisiin ja ravintotuotteisiin. Esimerkiksi proteiinihydrolysaatteja on käytetty vuosikymmeniä ihmisten ravitsemuksessa, erityisesti hypoallergeenisten äidinmaidonkorvikkeiden valmistuksessa vauvoille/lapsille, jotka ovat allergisia lehmänmaitoproteiinille.
Entsymaattinen tai kemiallinen hydrolyysi
Proteiinihydrolyysi – aminohappoja yhteen liittävien peptidisidosten katkaiseminen vettä lisäämällä – voidaan saavuttaa eri menetelmillä: kemiallisesti käyttämällä happoja tai emäksiä (emäksinen) tai entsymaattisesti (lähestymistapa, johon keskitymme). Vaikka proteiinien happo- ja emäksinen hydrolyysimenetelmien etuna on alhainen hinta, niillä on kielteisiä seurauksia valmistettujen hydrolysaattien ravitsemukselliseen laatuun. Happohydrolyysi johtaa välttämättömän aminohapon tryptofaanin täydelliseen tuhoutumiseen sekä metioniinin, kystiinin ja kysteiinin osittaiseen häviämiseen (Pasupuleki & Braun, 2010). Samoin alkalinen hydrolyysi johtaa useimpien aminohappojen täydelliseen tuhoutumiseen, vaikka tryptofaani voi säilyä ehjänä (Dai, et ai., 2014), (Hei, et ai., 2017).
Proteiinien entsymaattisen hydrolyysin tärkeimmät edut happo- ja emäksiseen hydrolyysiin verrattuna ovat:
- Hydrolyysiolosuhteet, kuten lämpötila ja pH, ovat lieviä eivätkä johda tunnettuun aminohappohäviöön.
- Proteaasientsyymin (entsyymien) käyttö on spesifisempää ja tarkempaa kontrolloitaessa hydrolyysin laajuutta ja peptidien kokoa.
- Pienet käytetyt entsyymimäärät voidaan helposti deaktivoida (esim. kuumentamalla 80–85 ºC:seen vähintään 3 minuutin ajan) hydrolyysireaktion pysäyttämiseksi. (Hei, et ai., 2017).
Entsymaattisesti hydrolysoidun proteiinin ravitsemukselliset edut: proteiinien sulavuus ja imeytyminen.
Käytetyn proteiinihydrolyysimenetelmän lisäksi, kuten aiemmin on hahmoteltu, proteiinihydrolysaattien ravintoarvo riippuu läsnä olevien vapaiden aminohappojen, pienten peptidien (tyypillisesti di- ja tripeptidien) ja suurten peptidien koostumuksesta. Historiallisesti uskottiin, että vain vapaita aminohappoja imeytyivät maha-suolikanavasta tietyt aminohappokuljettajat. Näin tapahtuu, mutta nyt tiedetään, että laajaspesifinen peptidikuljetusaine PepT1 absorboi suurimman osan aminohapoista di- ja tripeptideinä. (Fei, et ai., 1994). PepT1 voi mahdollisesti kuljettaa kaikkia 400 di- ja 8,000 20 tripeptidiä, jotka syntyvät XNUMX erilaisen ruokavalion aminohapon yhdistämisestä (Daniel, 2004). Tästä syystä olisi odotettavissa, että proteiinihydrolysaatin nauttiminen, joka sisältää suuria määriä di- ja tripeptidejä, helpottaisi proteiinien pilkkomista ja imeytymistä, mikä johtaa lisääntyneeseen sulavuuteen ja aminohappojen hyötyosuuteen.
On selvää, että parhaiden entsyymi- ja hydrolyysiolosuhteiden luominen on kriittistä, jotta voidaan luoda proteiinihydrolysaatteja, joilla on halutut lopulliset peptidikokoprofiilit. Peptidien kokojakauma voidaan määrittää käyttämällä kokoekskluusiokromatografiaksi kutsuttua tekniikkaa. Kokoekskluusiokromatografia (SEC) on analyyttinen kemian tekniikka, jossa liuokseen liuenneiden molekyylien (kuten proteiinien tai peptidien) seokset erotetaan niiden koon mukaan (kuten kuvassa 1 on esitetty).
KUVA 1. Yksinkertainen katsaus erikokoisten molekyylien erottamiseen liuoksessa kokoekskluusiokromatografialla (SEC). Liuos levitetään kolonniin, joka on täytetty huokoisten pallomaisten helmien (harmaiden pallojen) hartsilla. Suuret molekyylit (punaiset ympyrät) eivät pääse tunkeutumaan helmien huokosiin (reikiin), joten ne kulkeutuvat kolonnin läpi suhteellisen nopeasti ja ne havaitaan ensin. Näytteen sisällä olevat pienemmät molekyylit voivat päästä huokosiin vaihtelevassa määrin niiden koosta riippuen. "Keskikokoiset" molekyylit (vihreät ympyrät) pääsevät sisään joihinkin helmiin, mutta eivät toisiin, joten niiden kulkeminen kolonnin läpi kestää kauemmin, kun taas pienimmät molekyylit (siniset ympyrät) pääsevät kaikkiin huokosiin ja kestää pisin kulkeva sarakkeen läpi.
Menetelmät
raaka-aineet – Tuoreet näytteet kananruhosta, ankanruhosta ja lohen rungosta pienennettiin, homogenisoitiin paksuksi tahnaksi ja pakastettiin. Tuore lampaanmaksa pakastettiin kokonaisena. Materiaalit lähetettiin osoitteeseen Nofima, Ås, Norja, proteolyysiin ja analyysiin.
Proteolyysi – Jokaisesta raaka-aineesta (kana, ankka, lohi ja lammas) 500 g:n näyte sekoitettiin 990 ml:aan tislattua vettä lasisessa reaktioastiassa ja sekoitettiin nopeudella 300 rpm. Jokaiselle raaka-aineelle testattiin kolme erilaista proteaasientsyymiä kahdella eri pitoisuudella ja kahdella aikapisteellä, jolloin saatiin 48 hydrolysaattinäytettä analysoitavaksi.
Kokoekskluusiokromatografia – Hydrolysaattien vesiliukoisen proteiinifraktion molekyylipainojakauma määritettiin kokoekskluusiokromatografialla käyttämällä Shimadzu LC-20AT korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmää (HPLC) valodiodirividetektorilla (SPD M20A), joka oli asetettu 214 nm:iin.
Kollageenipeptidipitoisuus – Hydroksiproliini on modifioitu aminohappo, jonka läsnäolo rajoittuu pääasiassa kollageeniin. Proteiinihydrolysaattien hydroksiproliinipitoisuutta voidaan käyttää epäsuorana mittana läsnä olevan kollageenin/kollageenipeptidien määrästä. Nofima Biolab suoritti jokaisen raaka-aineen täydellisen aminohappoanalyysin (mukaan lukien hydroksiproliini); lisäksi hydroksiproliinipitoisuus määritettiin akkreditoidussa laboratoriossa (ALS, Norja) hydrolysaattien vesiliukoisesta fraktiosta.
tulokset
Hydrolysaattien peptidin kokojakauma – Yleensä kunkin testatun entsyymin osalta kunkin raaka-aineen inkubointi korkeammalla entsyymipitoisuudella ja pidempään johti "hyödylliseen" muutokseen hydrolysaattien peptidikokoprofiilissa (eli pienempien peptidien osuuden kasvuun ). Tämä on korostettu kuviossa 2, joka näyttää tulokset kullekin raaka-aineelle käyttämällä "parasta" entsyymiä "ei-optimaalisella" pitoisuudella ja kestolla verrattuna "optimaaliseen" pitoisuuteen ja kestoon. Optimoiduissa olosuhteissa havaitsimme, että 100 % peptideistä oli < 3 kDa ja yli 75 % oli < 0.5 kDa (kuvio 2).
Perustuu useiden useiden lajien (esim. rotta, sika, koira, ihminen, ks (Zhangi & Matthews, 2010) Yleiskatsausta varten on yleisesti hyväksyttyä, että:
- Peptidien imeytyminen on parempi kuin ehjä proteiini.
- Peptidien imeytyminen on parempi kuin vapaiden aminohappojen.
- Pienten peptidien imeytyminen on parempi kuin suurten peptidien.
Fysiologisesti suurin osa aminohapoista imeytyy pieninä peptideinä, jotka koostuvat kahdesta tai kolmesta toisiinsa liittyneestä aminohaposta (di- ja tri-peptidit, vastaavasti). Tästä syystä olisi odotettavissa, että proteiinihydrolysaatin nauttiminen, joka sisältää suuria määriä di- ja tripeptidejä, helpottaisi proteiinien pilkkomista ja imeytymistä, mikä johtaa lisääntyneeseen sulavuuteen ja aminohappojen hyötyosuuteen. Aminohapon keskimääräinen molekyylipaino on 2 daltonia (Da), joten di- ja tripeptidien molekyylipaino olisi noin 3-110 Da (220-330 kDa). Tuloksemme proteiinihydrolysaateista, joissa yli 0.2 % alle 0.3 kDa:n peptideistä (eli jopa ~ 75 aminohappoa) ovat alle 0.5 kDa:n (eli jopa ~ 5 aminohappoa), merkitsevät sitä, että proteiinipalasissamme oleva proteiini on hyvin sulavaa ja sitä syövien lemmikkieläinten helposti imeytyvää. Tämä on tarkoitus osoittaa ruokintatutkimuksella yhteistyössä Gentin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan kanssa.
Lisäksi 100 kDa:n tai sitä pienempien peptidien 3 %:n saavuttaminen vähentää riskiä laukaista allerginen reaktio proteiinilähteille, ja siksi sitä voidaan pitää hypoallergeenisena.
Kuva 2.
Peptidien kokojakauma (kDa) kunkin raaka-aineen hydrolysaattien vesifaasissa, jota on inkuboitu saman entsyymin kanssa "optimoimattomissa" ja "optimoiduissa" olosuhteissa entsyymipitoisuuden ja hydrolyysin keston osalta. Huomaa erityisesti, kuinka 1.0-3.0 kDa:n peptidien prosenttiosuus laskee ja <0.5 kDa:n peptidien lisääntyminen siirtyy "optimoimattomista" "optimoituihin" olosuhteisiin.
Kollageenipeptidipitoisuus
Kunkin testatun raaka-aineen osalta entsyymit A ja C suoriutuivat yleensä "paremmin" (mitä tulee hydrolysaattien vesifaasista suuremman prosenttiosuuden hydroksiproliinin talteenottoon) kuin entsyymi B, kun verrataan tiettyä hydrolyysin kestoa ja entsyymipitoisuutta (esim. lohen tulokset kuvassa 3).
Koska "ehjä" kollageeniproteiini ei liukene veteen, hydroksiproliinin ("kollageenin" markkerimme) läsnäolo vesifaasissa osoittaa, että kollageeniproteiini on pilkottu kollageenipeptideiksi (jotka ovat vesiliukoisia). Tuloksemme osoittavat, että pystymme entsymaattisen proteolyysin avulla luomaan raaka-aineita, jotka pystyvät tuomaan mahdollisia toiminnallisia etuja, kuten tukemaan nivelten terveyttä, ihon terveyttä ja suoliston terveyttä niissä olevien kollageenipeptidien kautta.
KUVA 3. Hydroksiproliinin (melkein yksinomaan kollageenista löytyvä aminohappo) prosenttiosuus, joka on otettu talteen hydrolysoidun lohen vesifaasissa kolmen eri entsyymin (A, B tai C) kanssa inkuboidun raaka-aineen (lohen) kanssa kahdessa eri pitoisuudessa (C1 tai C2) kaksi eri ajanjaksoa (T1 tai T2).
Yhteenveto
Nämä positiiviset tulokset tarjoavat mahdollisuuksia saada lisäarvoa kollageenin luonnollisesta läsnäolosta tietyissä raaka-aineissa luomalla kollageenipeptidejä, jotka voivat tarjota toiminnallisia etuja, kuten ylläpitää terveitä niveliä aktiivisilla lemmikeillä ja parantaa nivelten liikkuvuutta ja joustavuutta vanhemmilla lemmikeillä. esimerkki.
Suuri prosenttiosuus (> 75 %) pieniä peptidejä (<0.5 kDa) on tuotettu "optimoiduissa" olosuhteissa tämän tutkimuksen perusteella, ensimmäinen osa HDP tavoite saavutetaan. Seuraava tärkeä askel on osoittaa, että tällä HDP:llä valmistettu nappula on todellakin sulavampaa ja biologisempaa kuin nykyiset vastavalmistetut tuotteemme – teemme tämän kiireisenä ruokintatutkimuksessamme. Gentin yliopisto Eläinlääkärikoulu. Katso tätä tilaa!
Viitteet
- Cave, N., 2006. Hydrolysoitujen proteiinien ruokavaliot koirille ja kissoille. Veterinary Clinics Small Animal Practice, osa 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Eläinkudosten ja elintarvikkeiden proteiinien aminohappokoostumuksen analyysi o-ftaldialdehydijohdannaisina esikolonnissa HPLC:llä fluoresenssidetektiolla. J Chromatography B, Volume 964, s. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, Volume 66, s. 361-384.
- Fei, Y. et ai., 1994. Nisäkkään protoniin kytketyn oligopeptidin kuljettajan ekspressiokloonaus. Nature, Volume 7, s. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Proteiinien ja peptidien molekyylipainon karakterisointi lemmikkieläinten ruokien makuaineiden valmistuksessa. [Verkossa] Saatavilla osoitteessa: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteiinihydrosaatit eläinten ruokinnassa: Teollinen tuotanto, bioaktiiviset peptidit ja toiminnallinen merkitys. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Proteiinihydrolysaattien käsittely ja arviointi. Julkaisussa: Nutrition for Special Needs. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Parempaa läpinäkyvyyttä lemmikkieläinten ruokien proteiinien suhteen, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Proteiinihydrolysaattien valmistusta. Julkaisussa: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Proteiinihydrolysaatin imeytymisen fysiologinen merkitys ja mekanismit. Julkaisussa: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 135-177.